|
| |
|
| |
|
|
Detekce kovalentních komplexů proteinů s DNA s použitím fluorescenční mikroskopie
Melicharová, Růžena ; Jirkovská, Anna (vedoucí práce) ; Novotná, Eva (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra Biochemických věd Kandidát: Růžena Melicharová Školitel: PharmDr. Anna Jirkovská, Ph.D. Název diplomové práce: Detekce kovalentních komplexů proteinů s DNA s použitím fluorescenční mikroskopie Antracyklinová antibiotika patří mezi nejúčinnější protinádorová léčiva. Jejich mechanismus účinku je komplexní. Působí jako interkalační činidla, způsobují vznik DNA aduktů a působí na topoisomerasu (TopII) jako jedy. Katalytický cyklus TopII je přerušen ve chvíli, kdy antracykliny stabilizují kovalentní komplex DNA a TopII, a tím způsobují buněčné poškození. Použití antracyklinů je však limitováno několika závažnými nežádoucími účinky, jako je myelotoxicita či kardiotoxicita. Mechanismus kardiotoxicity stále není jasný, ale mohl by být spojený s působením na TopIIβ isoformu. TopIIβ je na rozdíl od TopIIα přítomna v buňkách diferencovaných, jako jsou kardiomyocyty. Navíc jediný klinicky používaný kardioprotektant dexrazoxan patří mezi TopII katalytické inhibitory. Nicméně detaily protektivního působení zajištěného dexrazoxanem jsou nejasné. Cílém této práce bylo optimalizovat metodu TARDIS (trapped in agarose DNA immunostaining) k detekci a kvantifikaci kovalentních komplexů, porovnat různé způsoby analýzy počtu komplexů a vybrat vhodnou...
|
|
|
Studium proteinů spermií různých savčích druhů
Pohlová, Alžběta ; Postlerová, Pavla (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Rozmnožování je základní charakteristikou všech zvířat a nezbytným krokem k produkci nové generace. Studium proteinů spermií je rozhodující pro pochopení vzájemného rozpoznání spermie a vajíčka. Zabývali jsme se povrchovými proteiny, které se podílejí na vazbě na zona pellucida a zkoumali, zda jsou tyto proteiny zachovány v rámci savčích druhů. Nepřímá imunofluorescenční mikroskopie byla použita k testování panelu monoklonálních protilátek, které byly připraveny proti povrchovým proteinům spermií prasete, na býčích a myších spermiích. Byla nalezena zkřížená mezidruhová reaktivita některých protilátek proti kančím spermiím na ejakulovaných spermiích býka a na epididymálních spermiích myši. Dále jsme izolovali proteiny spermií různých savčích druhů: prasete, býka, psa, kocoura, myši a člověka. Proteiny byly separovány elektroforeticky v přítomnosti SDS a byly porovnány proteinové a glykoproteinové profily epididymálních, ejakulovaných a in vitro kapacitovaných spermií. Interakce spermií se zona pellucida byly studovány na elektroforeticky separovaných povrchových proteinech spermií prasete a býka reakcí s biotinem- značenými glykoproteiny zona pellucida. Protilátky značící povrchové proteiny kančích spermií se zona pellucida vázající aktivitou byly použity ke sledování původu daného proteinu v...
|
|
|
Orphan Nuclear Receptor TLX (NR2E1) in Regulation of Cell Reproduction and Differentiation
Raška, Otakar ; Kostrouch, Zdeněk (vedoucí práce) ; Otová, Berta (oponent) ; Nedvídková, Jara (oponent)
Jaderné receptory zahrnují rozsáhlou rodinu transkripčních faktorů, které jsou silnými regulátory tkáňového metabolismu, homeostázy a vývoje tkáně živočišných druhů včetně člověka. Jsou zvláště zajímavé pro svoji schopnost reagovat na vyvázání hormonů, metabolitů, xenobiotik či uměle vytvořených molekul a převést interakci s těmito malými lipofilními molekulami do specifického regulačního signálu. Při hledání jaderných receptorů, jejichž úloha by mohla být kritická pro nervovou tkáň u bezobratlých a zachovalá během vývoje živočichů, jsme identifikovali blízký homolog TLX obratlovců u ploštěnky Schmidtea mediterranea. Ploštěnky představují velmi slibný biologický model pro studium tkáňové homeostázy a regenerace. Ploštěnky jsou schopny vstřebávat vlastní tkáně a použít je jako zdroj energie během hladovění, a pomocí neoblastů znovu vytvořit celé svoje tělo při dostatku potravy. Informatická analýza veřejně přístupných dat sekvenovacího projektu Schmidtea mediterranea ukázala, že genom planarií obsahuje minimálně jeden gen s vysokým stupněm podobnosti s genem tlx obratlovců. Klonovali jsme kompletní CDS (coding DNA sequence of cDNA) a charakterizovali jsme gen funkčně. Ukázali jsme, že TLX (NR2E1) vykazuje u ploštěnky a obratlovců vysokou podobnost v jejich celé délce kódující...
|
|
|
Detekce kovalentních komplexů proteinů s DNA s použitím fluorescenční mikroskopie
Melicharová, Růžena ; Jirkovská, Anna (vedoucí práce) ; Novotná, Eva (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra Biochemických věd Kandidát: Růžena Melicharová Školitel: PharmDr. Anna Jirkovská, Ph.D. Název diplomové práce: Detekce kovalentních komplexů proteinů s DNA s použitím fluorescenční mikroskopie Antracyklinová antibiotika patří mezi nejúčinnější protinádorová léčiva. Jejich mechanismus účinku je komplexní. Působí jako interkalační činidla, způsobují vznik DNA aduktů a působí na topoisomerasu (TopII) jako jedy. Katalytický cyklus TopII je přerušen ve chvíli, kdy antracykliny stabilizují kovalentní komplex DNA a TopII, a tím způsobují buněčné poškození. Použití antracyklinů je však limitováno několika závažnými nežádoucími účinky, jako je myelotoxicita či kardiotoxicita. Mechanismus kardiotoxicity stále není jasný, ale mohl by být spojený s působením na TopIIβ isoformu. TopIIβ je na rozdíl od TopIIα přítomna v buňkách diferencovaných, jako jsou kardiomyocyty. Navíc jediný klinicky používaný kardioprotektant dexrazoxan patří mezi TopII katalytické inhibitory. Nicméně detaily protektivního působení zajištěného dexrazoxanem jsou nejasné. Cílém této práce bylo optimalizovat metodu TARDIS (trapped in agarose DNA immunostaining) k detekci a kvantifikaci kovalentních komplexů, porovnat různé způsoby analýzy počtu komplexů a vybrat vhodnou...
|
|
|
Functional study of the SUF pathway in the cell of Monocercomonoides exilis and Paratrimastix pyriformis
Zelená, Marie ; Hampl, Vladimír (vedoucí práce) ; Verner, Zdeněk (oponent)
Syntéza železo-sirných center je nepostradatelný buněčný proces, který je závislý na složitých biosyntetických drahách. U modelových eukaryot jsou těmito drahami ISC v mitochondrii a CIA v cytosolu. Nedávná analýza genomu a transkriptomu amitochondriálního prvoka Monocercomonoides exilis prokázala, že tento organismus postrádá ISC dráhu, která byla nahrazena bakteriální SUF dráhou. Blízký volně žijící příbuzný M. exilis, Paratrimastix pyriformis, obsahuje organely příbuzné mitochondrii, přesto zde byla ISC dráha také nahrazena dráhou SUF. Získání SUF dráhy je považováno za podmínku pro následnou ztrátu mitochondrie u M. exilis, který je prvním zdokumentovaným eukaryotickým organismem zcela bez této organely. SUF dráha byla doposud předmětem mnoha studií u bakterií, avšak její role hlavního poskytovatele železo-sirných center pro eukaryotické buňky byla popsána pouze u několika případů, a to především na základě genomických dat. Tato práce se zabývá domnělou ATPázou SufC a domnělým proteinovým lešením SufB. Oba proteiny byly úspěšně izolovány v rekombinantní formě. U SufC byla naměřena ATPázová aktivita, která by zvýšená za přítomnosti SufB. Podmínky pro ATPázovou aktivity SufC byly standardizovány. Rekombinantní forma SufC byla použita k přípravě protilátky, která byla použita k lokalizaci SUF...
|
|
|
Detekce kovalentních komplexů proteinů s DNA s použitím fluorescenční mikroskopie
Melicharová, Růžena ; Jirkovská, Anna (vedoucí práce) ; Novotná, Eva (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra Biochemických věd Kandidát: Růžena Melicharová Školitel: PharmDr. Anna Jirkovská, Ph.D. Název diplomové práce: Detekce kovalentních komplexů proteinů s DNA s použitím fluorescenční mikroskopie Antracyklinová antibiotika patří mezi nejúčinnější protinádorová léčiva. Jejich mechanismus účinku je komplexní. Působí jako interkalační činidla, způsobují vznik DNA aduktů a působí na topoisomerasu (TopII) jako jedy. Katalytický cyklus TopII je přerušen ve chvíli, kdy antracykliny stabilizují kovalentní komplex DNA a TopII, a tím způsobují buněčné poškození. Použití antracyklinů je však limitováno několika závažnými nežádoucími účinky, jako je myelotoxicita či kardiotoxicita. Mechanismus kardiotoxicity stále není jasný, ale mohl by být spojený s působením na TopIIβ isoformu. TopIIβ je na rozdíl od TopIIα přítomna v buňkách diferencovaných, jako jsou kardiomyocyty. Navíc jediný klinicky používaný kardioprotektant dexrazoxan patří mezi TopII katalytické inhibitory. Nicméně detaily protektivního působení zajištěného dexrazoxanem jsou nejasné. Cílém této práce bylo optimalizovat metodu TARDIS (trapped in agarose DNA immunostaining) k detekci a kvantifikaci kovalentních komplexů, porovnat různé způsoby analýzy počtu komplexů a vybrat vhodnou...
|
|
|
Studium proteinů spermií různých savčích druhů
Pohlová, Alžběta ; Postlerová, Pavla (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Rozmnožování je základní charakteristikou všech zvířat a nezbytným krokem k produkci nové generace. Studium proteinů spermií je rozhodující pro pochopení vzájemného rozpoznání spermie a vajíčka. Zabývali jsme se povrchovými proteiny, které se podílejí na vazbě na zona pellucida a zkoumali, zda jsou tyto proteiny zachovány v rámci savčích druhů. Nepřímá imunofluorescenční mikroskopie byla použita k testování panelu monoklonálních protilátek, které byly připraveny proti povrchovým proteinům spermií prasete, na býčích a myších spermiích. Byla nalezena zkřížená mezidruhová reaktivita některých protilátek proti kančím spermiím na ejakulovaných spermiích býka a na epididymálních spermiích myši. Dále jsme izolovali proteiny spermií různých savčích druhů: prasete, býka, psa, kocoura, myši a člověka. Proteiny byly separovány elektroforeticky v přítomnosti SDS a byly porovnány proteinové a glykoproteinové profily epididymálních, ejakulovaných a in vitro kapacitovaných spermií. Interakce spermií se zona pellucida byly studovány na elektroforeticky separovaných povrchových proteinech spermií prasete a býka reakcí s biotinem- značenými glykoproteiny zona pellucida. Protilátky značící povrchové proteiny kančích spermií se zona pellucida vázající aktivitou byly použity ke sledování původu daného proteinu v...
|
|
|
Zavedení histoscanningu pro rutinní hodnocení biopsií nativních a transplantovaných ledvin.
ŠMOLÍKOVÁ, Petra
Cíl: Imunofluorescence se využívá k diagnostice nativních i transplantovaných ledvin, ačkoliv má řadu limitů: krátká doba expirace, obtížná manipulace a zasílání. Materiál a metody: 20 případů bylo zpracováno a hodnoceno klasickou metodou, následně scannováno pomocí 3D Histech a opět posouzeno jako virtuální preparáty. Výsledky: Primární sada byla znovu hodnocena. Na základě výsledků byla modifikována technologie ( medium, krycí skla a systém histoscanningu). 143 nových případů bylo zpracováno modifikovaně, hodnoceno na klasických i virtuálních sklech. Rozdíly obou technik byly přijatelné a systém byl uveden do praxe. Závěr: Virtuální mikroskopie je použitelná i pro imunofluorescenční techniku a je v naší instituci používána rutinně. Současně se scannováním základních a imunohistochemických skel je používána pro tzv. telepatologii. Největší výhodou je jednoduchý a rychlý přístup z velké vzdálenosti.
|
host ::
RSS.